** حروف کوچک غیرمشابه در هر ردیف و حروف بزرگ غیرمشابه در هرستون نشان دهنده اختلاف معنادار (۰۵/۰< P) بین آنها است.
با توجه به گزارشات ارائه شده در جدول، ریزپوشانی با اختلاف معناداری باعث افزایش در پایداری سلولهای پروبیوتیک شده است. سلولهای زنده و آزاد بعد از اینکه وارد فاز لگاریتمی شدند، در طی نگهداری در یخچال بعد از گذشت ۳ الی ۴ روز تعداد آنها به شدت کاهش پیدا کرد در صورتیکه بعد از گذشت ۲۱ روز از ماندگاری سلولهای پروبیوتیک درون ریزپوشینههای صمغ فارسی تولید شده به روش امولسیون دوگانه، تعداد سلولها تا روز ۱۸ فقط یک سیکل لگاریتمی کاهش مشاهده شده است و تا زمان ۲۱ روز تعداد آنها هنوز مطابق با میزان مورد نظر (۶ سیکل لگاریتمی) بوده است. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که ریزپوشانی به روش امولسیون دوگانه و با بهره گرفتن از صمغ فارسی، در مدت زمان نگهداری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 موثر بوده است. البته مطالعات نشان میدهد که فرایند ریزپوشانی، به صورت کلی یکی از روش های افزایش زندهمانی سلولهای پروبیوتیک به شمار میآید. نتایج تحقیقات برینکس و همکاران در سال (۲۰۱۱) نشان داد که ریزپوشانی با بهره گرفتن از آلژینات و پکتین، همچنین آلژینات سدیم و کیتوزان با بهره گرفتن از روش امولسیون باعث افزایش در زندهمانی پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم شده است و نتایجی از این قبیل، نشان دهنده صحت این موضوع میباشد.
تحقیقات روی سویهی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 نشان داده است که این سلولهای میکروبی پس از ۱۸ ساعت گرمخانهگذاری وارد فاز سکون میشوند (میرلوحی، ۱۳۸۸). به همین دلیل در تحقیق حاضر و طبق نتایج حاصل از نمودار رشد که در بخش ۴-۳ گزارش شده، جداسازی سلول در ابتدای ورود به فاز سکون باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم انجام شد.
۴-۶- میزان بقا سلولهای آزاد و ریزپوشانیشده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست در طول نگهداری
پس از شمارش جمعیت میکروبی در فواصل زمانی سه روز طی مدت ۲۱ روز نگهداری مشخص شد که اثر ریزپوشانی برمیزان بقا سلولهای باکتری در ماست طی زمان های مختلف معنیدار بوده است (جدول ۴-۹)، بنابراین مقایسهی میانگین با آزمون LSD انجام شد.
جدول ۴-۹- میزان بقا سلولهای آزاد و ریزپوشانیشده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست طی دوران نگهداری در مدت ۲۱ روز*

* داده ها بر حسب میانگین سه تکرار و دو مشاهده لگاریتم تعداد کلنی در یک میلیلیتر گزارش شده است.
** حروف کوچک غیرمشابه در هر ردیف و حروف بزرگ غیرمشابه در هرستون نشان دهنده اختلاف معنادار (۰۵/۰< P) بین آنها است.
*** تیمار اول مربوط به نمونه ماست حاوی پروبیوتیک ریزپوشانیشده است و تیمار دوم مربوط به ماست حاوی سلولهی آزاد است.
همانطور که در جدول ۴-۹ مشاهده میشود، جمعیت سلولهای ریزپوشانیشده و آزاد ماست پس از پایان دوره نگهداری ۲۱ روزه، به ترتیب به تعداد CFU ml-1 ۱۰۸× ۱/۲ و ۱۰۷×۴/۳ باقی مانده است، که با حداقل میزان جمعیت سلولی پیشنهاد شده در فراوردههای لبنی (حداقل CFU ml-1109-107 سلول پروبیوتیک در گرم یا میلیلیتر فراورده) مطابقت دارد (استانتن و همکاران، ۱۹۹۸). به این ترتیب طی مدت ۲۱ روز انبارمانی در دمای ۴ درجه سانتیگراد، ۸/۰ سیکل لگاریتمی از جمعیت پروبیوتیکهای ریزپوشانیشده کاهش یافته و در مورد جمعیت سلولهای آزاد این مقدار برابر با ۶/۱ سیکل لگاریتمی میباشد. همانطور که در جدول مشاهده میکنید روند کاهش تعداد پروبیوتیکها در نمونه های ریزپوشانی شده معنادار نبوده و این در حالی است که این روند کاهش در مورد سلولهای آزاد معنادار است. همچنین اختلاف سلولهای پروبیوتیک آزاد و ریزپوشینه در زمان های نمونه برداری با یکدیگر دارای اختلاف معنیدار هستند و این در حالی است که در روز صفر شمارش تعداد آنها از نظرآماری دارای اختلاف معنیدار نیست. بر اساس این نتایج میتوان گفت، ریزپوشانی باعث افزایش بقا سلولها در ماست طی ۲۱ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتیگراد بوده است. علاوه بر این سویهی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در مقایسه با باکتریهای پروبیوتیک دیگری که پایداری آنها در بستر ماست بررسی شده پایدارتر است (کایلاسپاتی .ک.، ۲۰۰۶؛ پیکوت و همکاران، ۲۰۰۳).
محققان زیادی پایداری ضعیف باکتریهای پروبیوتیک را در ماست گزارش کردهاند (شاه و همکاران، ۲۰۰۰؛ لاورنس و همکاران، ۲۰۰۱). کاهش pH در اثر فعالیت سویههای لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در ماست، مهمترین عامل تهدیدکننده بقاء پروبیوتیکها در این محیط است (میرلوحی. م، ۱۳۸۸). تحقیقات نشان داده است که ریزپوشانی روش سودمندی جهت حفاظت از کشتهای پروبیوتیکی در غذاهای اسیدی مانند ماست است (کباری و همکاران، ۱۹۹۸). ریزپوشانی با کنترل تولید اسید توسط کشتهای پروبیوتیکی، مدت زمان نگهداری فراوردههای غذایی را افزایش می دهد (مرتضوی و همکاران، ۲۰۰۷). بر اساس نتایج به دست آمده در تحقیق حاضر در بند ۴-۸-۱، پس اسیدزایی در ماست حاوی باکتریهای پروبیوتیک ریزپوشانیشده کندتر از ماست حاوی سلول های آزاد بود. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که ریزپوشانی باعث سهولت تولید فراوردههای لبنی تخمیری میشود، که در آنها پایداری باکتریهای پروبیوتیک طی دوره نگهداری حفظ میشود. وجود تنشهای سرما، شرایط اسیدی و آزاد شدن بعضی از سلولهای باکتری به دلیل متلاشی شدن ریزپوشینهها طی دوره نگهداری، از عوامل اصلی کاهش جمعیت سلولها است. بنابراین ممکن است کاهش سلولها در این تحقیق به دلیل شکسته شدن برخی از ذرات امولسیون در طول انبارمانی باشد. سلنتا و همکاران (۲۰۰۰) گزارش کردند که کاهش میزان بقاء باکتریهای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و گونه های بیفیدوباکتریوم ریزپوشانیشده در ماست، طی ۸ هفته انبارمانی حدود ۵/۰سیکل لگاریتمی بود، در حالیکه کاهش تعداد سلولهای آزاد در همین شرایط یک سیکل لگاریتمی بود (سلطانا و همکاران، ۲۰۰۰). ادهیکاری و همکاران (۲۰۰۰) مشاهده کردند که سلولهای آزاد دو گونه باکتری بیفیدوباکتریوم لانگوم به میزان ۷۸-۷۰ درصد میزان بقاء خود را در ماست، طی ۳۰ روز نگهداری در دمای یخچال از دست دادند، در حالیکه در مورد سلولهای ریزپوشانیشده در کاپا- کاراگینان جمعیت سلولی طی دوره نگهداری تغییری نکرد(ادهیکاری و همکاران، ۲۰۰۰). گودوارد و کیلاسپاسی (۲۰۰۳) گزارش کردند که ریزپوشانی میزان بقاء باکتریهای پروبیوتیک را در ماست بهبود بخشید. کیلاساپاسی (۲۰۰۶) نشان داد که ۴ و ۳ سیکل لگاریتمی کاهش، به ترتیب در جمعیت سلولهای آزاد لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدوباکتریوم لاکتیس، طی ۷ هفته نگهداری در ماست مشاهده شد. آنها گزارش کردند که در اثر ریزپوشانی میزان بقاء باکتریهای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدوباکتریوم لاکتیس به میزان ۱ و ۲ سیکل لگاریتمی افزایش یافت. نتایج کاستیلا و همکاران (۲۰۱۰) و آدهیکاری و همکاران (۲۰۰۳) نشان داد که کاهش pH و جمعیت باکتریهای پروبیوتیک ریزپوشانی شده در ماست در سطح (۰۵/۰>p) معنیدار نبود. این مسئله در مورد مطالعات پیکوت و همکاران (۲۰۰۴) نیز صدق میکند. همانطور که گزارشات حاصل در جدول ۴-۱۰ نیز نشان میدهد، گزارشات مذکور با اطلاعات به دست آمده در این تحقیق مطابقت دارد.
تفاوتهای چشمگیری میان میزان بقاء گونه های مختلف باکتریهای پروبیوتیک در محیط اسیدی وجود دارد. مشکل حساسیت کشتهای پروبیوتیک به اسید، با افزایش میزان اسیدیته طی انبارمانی که به فرایند اسیدزایی شدید[۶۶] معروف است، ارتباط دارد. این فرایند به دلیل فعالیت بتا-گالاکتوزیداز در دمای ۵-۰ درجه سانتیگراد طی نگهداری رخ میدهد. در این زمینه ممکن است pH تا میزان کمتر از ۲/۴ نیز کاهش یابد، که در این صورت میزان یونهای هیدروژن در محیط از میزان یونهای لاکتات بیشتر میشود و باعث میشود بر بقاء باکتریهای اسید لاکتیک تاثیرگذار باشد (راسیک و همکاران، ۱۹۷۸).
با توجه به نتایج به دست آمده میتوان گفت که ریزپوشانی با کنترل pH فراوردههای لبنی، مدت زمان انبارمانی آنها را افزایش میدهد و باعث بهبود پایداری سلولهای پروبیوتیک در شرایط اسیدی ملایم محصولی مانند ماست میشود. بنابراین توسط تکنیک ریزپوشانی میتوان مدت زمان نگهداری فراوردههایی نظیر ماست پروبیوتیک حاوی سلولهای لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، که شرایط اسیدی ملایم دارند را افزایش داد.
۴-۷- نتایج ارزیابی مقاومت سلولهای آزاد و ریزپوشانیشده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست، قبل و بعد از افزودن به ماست در شرایط شبیهسازی شده گوارشی
هدف از انجام این آزمایشها، ارزیابی میزان بقاء و مقاومت باکتریهای پروبیوتیک نسبت به pH معده و نمکهای صفراوی موجود در سیستم گوارشی بود (چمپاژن و همکاران، ۲۰۰۵). هر چند pH معده انسان در شرایط گرسنگی ممکن است تا ۱=pH کاهش یابد، اما در اکثر مطالعات آزمایشگاهی از pH برابر با ۳/۲ استفاده شده است. دلیل آن این است که در تحقیقات زیادی جمعیت سلولها در pH کمتر از ۲ به شدت کاهش مییابد، البته در مواردی گزارش شده است که سویههای لاکتوباسیلوس در pH برابر با یک توانایی حفظ میزان بقاء خود را دارند (سلطانا و همکاران، ۲۰۰۰). در تحقیق حاضر جهت ارزیابی اثر pHاسیدی معده و نمکهای صفراوی بر پایداری سلولهای آزاد و ریزپوشانیشده قبل و بعد از افزودن به ماست از یک سیستم برون زیستی استفاده شد(تهیه این سیستم در بند ۳-۱۲ توضیح داده شده است). تیمارهای مختلف به مدت ۲ ساعت در معرض عصارهی شبیهسازی شده معده با pHبرابر با ۳/۲ استفاده شد. برای نمکهای صفراوی نیز از pH برابر با ۵/۷ و به مدت ۲۴ ساعت استفاده شد. با توجه به نتایج مندرج در جدول ۴-۱۰ و ۴-۱۱، اثرزمان بر تیمارهای مختلف در سطح احتمال ۱/۰ درصد معنیدار بود. بنابراین مقایسه میانگین این اثرات متقابل با بهره گرفتن از آزمون LSD انجام شد.
جدول ۴-۱۰- میزان بقا تیمارهای مختلف لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 قبل و بعد از قرارگرفتن در شرایط اسیدی معده (۲ ساعت) *