1-8-نشانگرهای مولکولی.. 7
1-9-انواع نشانگرهای مولکولی.. 8
1-9-1-نشانگرهای مورفولوژیکی.. 9
1 -9-2-نشانگرها بیوشیمیایی.. 9
1-9-3-نشانگرهای DNA.. 10
1-10-انواع نشانگرهای مولکولی جدید. 12
1-10-1-RFLP. 12
1-10-2-RAPD.. 12
1-10-3- AFLP. 13
1-10-4- SSR.. 13
1-10-5- نشانگر مولکولی ISSR.. 14
1-10-5-1-مزایای ISSR.. 15
1-10-5-2-کاربردهای نشانگر ISSR.. 15
1-10-5-3-منشاء چند شکلی در ISSRها 18
1-11- گیاه­شناسی.. 20
1-12- ریشه. 20
1-13-ساقه. 20
1-14-گل.. 20
1-15-میوه 21
1-16-برگها 21
1-17-کاشت… 23
1-18- برداشت… 24
فصل دوم : بررسی منابع
2-1- نشانگر. 25
2-2-انواع نشانگر. 25
2-2-1-نشانگر RAPD.. 25
2-2-2-نشانگر AFLP. 26
2-2-3-نشانگر SSR.. 27
2-2-4-نشانگر ISSR.. 29
فصل سوم : مواد و روش­ها
3-1- تجهیزات و مواد مورد نیاز جهت آزمون شیمیایی، میکروبی و PCR.. 32
3-1-1- تجهیزات مورد استفاده 32
3ـ1ـ2ـ مواد مورد استفاده 34
3-1-3- بافرها و محلول­ها 34
3-1-3-3- بافر TBE (TRIS-Boric acid-EDTA) 34
3-1-3-4- محلول EDTA.. 35
3-1-3-5- NaOH.. 35
3-1-3-6- CTAB BUFFER.. 35
3-2-خصوصیات مکان آزمایشی.. 35
3-3- طرح آزمایشی و فاکتورهای مورد مطالعه. 35
3-4- نحوه انجام آزمایش… 36
3-4-1-مواد گیاهی.. 36
3-4-2-استخراج DNA ژنومی گیاه 37
3-4-2-1-استخراج DNA ژنومی به روش CTAB.. 37
3-4-2-2-نحوه تهیه ژل الکتروفورز. 38
3-5-انجام واکنش PCR.. 38
3-6-مواد لازم جهت انجام PCR.. 39
3-6-1-آغازگر. 39
3-6-5-آنزیم Taq DNA polymerase. 39
3-7-تنظیم شرایط برای PCR.. 40
3-8-الکتروفورز و رنگ­آمیزی محصول PCR.. 42
3-9-تجزیه و تحلیل داده‌ها 42
فصل چهارم : نتایج و بحث
4-1-جوانه­زنی و سبز شدن گیاهان. 43
4-2-کمیت و کیفیت DNA استخراجی.. 44
4-3-PCR نمونه­ها 44
4-4- روابط فیلوژنتیک بین ژنوتیپ­ها 45
فصل5 : نتیجه گیری
تفسیر….48
نتیجه­گیری.. 49
بحث… 50
پیشنهادات… 51
منابع فارسی.. 52
منابع انگلیسی.. 59
چکیده
روغن یکی از ضروری ترین مواد غذایی برای تغذیه انسان بوده که کمیت و کیفیت آن تاثیر چشمگیری بر سلامت انسان دارد. دانه­های روغنی دومین منبع غذایی مردم جهان را تشکیل می دهند. آفتابگردان زراعی Helianthus annuus که جزء گیاهان صنعتی، دیپلوئید با تعداد کروموزوم پایه (x=n=17) دولپه و یکساله است. تنوع موجود در یک ژرم­پلاسم می­تواند، منجر به تولید ارقام بهتر و همچنین استفاده از این تنوع در جهت بهبود خصوصیات رقم زراعی گردد. با توجه به این موضوع لزوم تعیین تنوع ژنتیکی در این گیاه از اهمیت ویژه ای برخوردار است و استفاده از روش های جدید ارزیابی تنوع ژنتیکی به منظور انتخاب والدین دو رگ و تعیین میزان قرابت ارقام ضروری می باشد. دراین ارتباط بهترین روش استفاده از نشانگرهای مولکولی می باشد، زیرا تعیین تنوع به وسیله نشانگرهای مورفولوژیکی با توجه به اثرات متقابل محیط و ژنوتیپ و فنوتیپ

گیاهان، کارایی شاخص های مورفولوژیکی را کم می نماید. در این مطالعه به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 18 توده آفتابگردان خراسان شمالی از نشانگر مولکولی ISSR که مبتنی بر PCR است، استفاده شد. برای استخراج DNA از روش CTAB استفاده شد و تکثیر ژنوم نمونه ها با استفاده از 10 پرایمر اختصاصی ISSR انجام پذیرفت. سپس با الکتروفورز ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید، قطعات تکثیر شده مورد ارزیابی قرار گرفتند.که از مجموع 101 باند تولید شده 43 باند منومورف و 58 باند از آنها چند شکل بودند. درصد چند شکلی برای هر آغازگر از 75/28 درصد برای آغازگر A11-B22 تا 81/81 درصد برای آغازگر 3RAمتغییر بود. در این بررسی توزیع مقادیر PIC بین 27/0 تا 49/0 با میانگین 45/0 متغییر بود. شاخص نشانگر در آغازگر های مورد مطالعه بین 93/7 تا 51/40 قرار داشت. بیشترین مقدار شاخص نشانگر متعلق به آغازگر RA3 بود که نشان دهنده قدرت تفکیک بالاتر این آغازگر در مقایسه با سایر آغازگرها است. که با توجه به میزان محتوای اطلاعات چند شکلی آغازگرها وشاخص نشانگر، آغازگر های A11 و RA3 و 1RR در بررسی تنوع ژنتیکی مناسب می باشند. میزان فاصله ژنتیکی ژنوتیپ­ها با استفاده از روش UPGMA و در نرم­افزار NTSYS محاسبه و ارتباط ژنوتیپ­ها با استفاده از دندروگرام نشان داده شد. دندروگرام حاصل از تجزیه و تحلیل مجموع الگوهای باندی حاصل از پرایمرهای مورد استفاده، توده­ها را در سطح 5/61 درصد به 6 گروه تقسیم نمود. با توجه به اهداف این تحقیق می­توان به این نتایج رسید که بررسی تنوع ژنتیکی تود­های آفتابگردان با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR امکان پذیر بوده و با استفاده از این نشانگر می­توان توده­های مورد بررسی را به گروه­های مختلف تقسیم­بندی کرد. همچنین به وسیله فاصله ژنتیکی به دست آمده بین توده­ها، با توجه به درصد تشابه آنها می­توان توده­ها با فاصله ژنتیکی بیشتر را جهت استفاده در مراکز تحقیقاتی جهت تولید بذور هیبرید با هتروزیس مطلوب استفاده نمود.
کلمات کلیدی: آفتابگردان، تنوع ژنتیکی، چند­شکلی، نشانگر، ISSR

 
1-1-اهمیت و ضرورت انجام تحقیق
روغن یکی از ضروری­ترین مواد غذایی برای تغذیه انسان بوده که کمیت و کیفیت آن تاثیر چشمگیری بر سلامت انسان دارد (ناصری, 1375). دانه­های روغنی دومین منبع غذایی مردم جهان را تشکیل می­دهند (باراک[1]، 2006). این محصولات علاوه بر دارا بودن ذخایر اسیدهای­چرب حاوی پروتئین نیز می­باشند. استفاده از پروتئین­های گیاهی به جای گوشت و نیز معرفی دانه­های روغنی جدید مانند سویا و کلزا به بازار­های جهانی سبب اهمیت روز افزون این محصولات شده است. همگام با رشد جمعیت و بهبود سطح زندگی به خصوص در کشور­های در حال توسعه، تقاضا برای روغن­ها و نیز پروتئین­های گیاهی که از محصولات فرعی دانه­های روغنی می­باشد، افزایش یافته است و از این رو یکی از مهم­ترین مسائل مورد بحث در کشاورزی و صنعت کشور­ها به شمار می­رود (کاکای[2] و همکاران، 2009). همچنین افزایش مصرف کنجاله دانه­های روغنی در تغذیه دام و طیور نیز نیاز به تولید دانه­های روغنی را در جهان افزایش داده است (سیداحمدی و کریمی, 1382). اهمیت روغن­های نباتی نیز به دلیل افزایش جمعیت و بالا رفتن میزان مصرف، روز به روز بیشتر می­شود. از این رو لزوم برنامه­ریزی بلند مدت و منسجم با هدف نیل به خود کفایی در تولید روغن خوراکی غیر قابل انکار خواهد بود (شیرانیان و دهشیری[3]، 2003 ).
مصرف روغن در ایران طی سالهای اخیر به دلیل رشد جمعیت و مصرف سرانه، افزایش یافته است، به طوری که با در نظر گرفتن مصرف سرانه 14 کیلو­گرم، سالانه حدود 750 هزار تن روغن مورد نیاز می­باشد. این در حالی است که کمتر از 10% از این روغن، در داخل کشور تولید می­گردد (سپهر و همکاران، 1382)
در حال حاضر بیش از 85% روغن خوراکی مورد نیاز کشور از خارج وارد می­شود که این به نوبه خود سبب وابستگی شدید به واردات روغن و در نتیجه خروج ارز از کشور می­شود با توجه به اهمیت روغن در جیره غذایی انسان، ضرورت کشت دانه­های روغنی و نزدیک شدن به خود کفایی در زمینه تولید روغن مورد نیاز کشور بسیار پراهمیت می­باشد (عطایی­کچویی و همکاران، 1388).
آفتابگردان یکی از مهم­ترین گیاهان روغنی به شمار می­آید که بعد از پنبه و سویا بیش­ترین سهم تولید داخلی را به خود اختصاص داده است (خطیبی و همکاران، 1392) روغن آن به دلیل داشتن اسیدهای چرب غیراشباع فراوان و همچنین فقدان کلسترول از کیفیت بالایی برخوردار است (نظامی و همکاران، 2008). و سطح زیر کشت آن در سال­های اخیر در کشور کاهش یافته است (صفاری، 1381) و درحال حاضر بیش از80000 هکتار می­باشد (رحیمی و همکاران، 1382). این محصول با داشتن حدود 40-50% روغن با کیفیت مطلوب، می­تواند به عنوان یک گیاه زراعی مطمئن در دامنه وسیعی از شرایط محیطی، عملکرد قابل توجهی داشته باشد (کریم­زاده­اصل، 1382)
آفتابگردان عمدتا به عنوان یک منبع تامین کننده روغن در جهان مطرح است. و عملکرد آن در خاک­های نسبتا فقیر رضایت­بخش بوده و به همین دلیل در محدوده وسیعی از زمین­های کشاورزی کشت می­شود. به گرما و سرما مقاوم است در مواردی که درجه حرارت از 10 درجه سانتی­گراد کمتر نشود، رشد نمو آن رضایت­بخش خواهد بود این درجه حرارت کمتر را بدون صدمه می­تواند تحمل کند این سازگاری مطلوب باعث گردیده که کشت آن در شرایط اقلیمی متفاوت امکان­پذیر گردد (کوچکی و همکاران، 1367).
1-2-پرسش تحقیق
آیا امکان بررسی تنوع ژنتیکی توده­های بومی آفتابگردان استان خراسان شمالی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR وجود دارد؟
آیا در بین توده­های مورد بررسی تنوع ژنتیکی وجود دارد؟
1-3-اهداف تحقیق
ارزیابی امکان استفاده از نشانگر مولکولی ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی آفتابگردان
بررسی تنوع ژنتیکی توده[4]­های آفتابگردان مورد بررسی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR
تعیین میزان فاصله ژنتیکی بین توده­های مورد بررسی و استفاده از اطلاعات به دست آمده در مراکز تحقیقاتی
1-4-فرضیه­ها
تنوع ژنتیکی بین توده­های بومی آفتابگردان استان خراسان شمالی وجود دارد.
برای تشخیص تنوع ژنتیکی آفتابگردان، می­توان از نشانگرهای مولکولی استفاده کرد.
روش ISSR روش مناسبی برای بررسی تنوع ژنتیکی است.
1-5-هنر و دانش اصلاح نباتات
هنر اصلاح نبات به مهارت اصلاح کننده در مشاهده و تشخیص خصوصیات اقتصادی، محیطی، تغذیه­ای یا ارثی وابسته است. قبل از اینکه اصلاح کنندگان، آگاهی و دانش کنونی را کسب نمایند، به طور عمده به مهارت و داوری خود در انتخاب گیاهان جدیدی که به طریق بذر یا رویشی تکثیر می­شد تکیه داشتند. بنابراین انتخاب، قدیمی­ترین شکل اصلاح نبات بود (اسلیپر و پولمن[5]، 1387).
اگرچه، گیاهان زراعی در ابتدا به واسطه نتایج جستجوی غیرهدفمند انسان (برای منابع مناسب غذا) رو به تکامل نهادند اما امروزه این امر بیشتر از طریق برنامه­های اصلاحی مدبرانه حاصل می­شود. در حالیکه تغییرات در فعالیتهای زراعی و مکانیزاسیون کشاورزی، تاثیر چشمگیری بر بهره­وری زراعی داشته اند، بهبود عملکرد اغلب گیاهان به سبب بهبود ژنتیکی آنها بوده است. علیرغم پیشرفتهای حاصله، بهبود بیشتر عملکرد و کیفیت محصولات، به سبب رشد جمعیت، افزایش قیمت نهاده­هایی چون آب، کود و انرژی و ملاحظات مربوط به اثرات کودها و سموم شیمیایی بر زیست بوم و تغییر سریع صلایق مصرف کنندگان، مورد درخواست مستمر قرار دارد (دارویس و سولار[6]، 1983). با پیشرفت دانش ژنتیک و سایر علوم گیاهی وابسته، اصلاح نباتات به علم تبدیل گردید. اصلاح نباتات بر پایه­ی تشخیص ژن به عنوان واحد وراثت، روشهای تغییر و تحول ژنی و نقش رفتار ژنتیکی، که امکان برآورد دقیق نتایج حاصل از تغییر و تحول ژنی را می­دهد بنیان نهاده شد. ژنها با آثارشان بر روی ظهور قابل مشاهده­­ی صفات گیاهی نظیر پاکوتاهی یا پابلندی یا رنگ سفید یا صورتی گل شناسایی می­شدند. از طریق دگرگرده­افشانی مهار شده ترکیبات ژنی ویژه­ای از صفات مطلوب مختلف به داخل یک رقم گیاهی ادغام می­گردید.اخیرا دانش ژنتیک مولکولی برای پیشرفت اصلاح نبات، به سطح بالاتری از تکنیک تجربی ارائه گردیده است. ژنتیک مولکولی در توصیف ساختار شیمیایی اسید دی­اکسی­ریبونوکلئیک (DNA)، ماده­ای که سازنده­ی ژن است، مشارکت دارد (اسلیپر و پولمن, 1387).
1-6-چرا گیاهان اصلاح می­شوند؟
هدف اصلاح نبات تغییر وراثت گیاهی به روش­هایی است که عملکرد گیاهی را بهبود بخشد. بهبود عملکرد گیاهی از راه­های بسیاری مورد عمل قرار می­گیرد. معمولا اهداف اصلی به­نژادی افزایش عملکرد و کیفیت است اگرچه محصول برداشتی دانه، علوفه، الیاف، میوه، غده، گل و یا سایر اندام­های گیاهی باشد، منشا اصلی غذای مردم جهان می­باشند. عملکرد بالاتر محصولات گیاهی تاثیر مهمی در تامین غذای فراوان و سودمندتر شدن کشاورزی و کاهش هزینه­ی محصولات غذایی برای مصرف کننده بر عهده دارند. به­نژادی برای بهبود کیفیت در غذاهای گیاهی، موجب مغذی­تر شدن محصول و افزایش سهولت در تهیه غذا یا کاهش حضور ترکیبات سمی می­گردد. افزایش سلامت گیاه بر اثر به­نژادی، که منجر به مقاومت در برابر بیماری و آفت می­شود، عملکرد و کیفیت محصول را در محیطی با عملیات زراعی مطلوب افزایش می­دهد و مصرف سموم شیمیایی را کاهش می­دهد (اسلیپر و پولمن, 1387).
 1-7-تنوع ژنتیکی[7]
1-7-1-تنوع ژنتیکی و اهمیت مطالعه آن     
تنوع، مبنای همه گزینش­هاست. انتخاب ژنوتیپی نیز نیازمند تنوع می­باشد. با بالا رفتن تنوع ژنتیکی در یک جامعه حدود انتخاب چه در انتخاب طبیعی و چه بطور مصنوعی وسیع­تر می­شود. با توجه به رابطه مثبت دربین کمیت تنوع ژنتیکی و مقدار وقوع تغییرات تکاملی در آن رابطه مشابهی نیز در بین کارایی بهبود ژنتیکی اصلاح یک جامعه و تنوع ژنتیکی برای صفت مورد علاقه موجود است (عبد­میشانی و شاه­نجات­بوشهری، 1376).
جایگزینی ارقام محلی توسط ارقام جدید و خالص (و تولید وسیع یک رقم برتر) تنوع ژنتیکی را در برنامه­های زراعی کاهش داده است. خطری که وجود دارد این است که برای برنامه­های اصلاحی آینده ممکن است با روند توسعه صنعتی و کشاورزی فشرده در مناطق تنوع ژنتیکی، منابع ژنتیکی ارزشمند از دست بروند (رنجبر، 1386).
تنوع بین گیاهان یک گونه خاص بر دو نوع است، تنوع بر اثر محیط که گیاه به مقادیر مختلف تنش محیطی واکنش می­دهد و با مقایسه گیاهان دو جمعیتی که از لحاظ ژنتیکی یکنواخت هستند، می­توان آنرا مشاهده نمود. تاثیر محیط روی یک گیاه، به نتاج آن منتقل نمی­شود و بنابر این نژاد­های انتخاب شده واکنش یکسانی به تنش­های محیطی خواهند داشت. دسته دوم تنوع ارثی است، این نوع تنوع، به تنوع موجود در یک جمعیت مخلوط ژنتیکی، که از عوامل ارثی ناشی شده و به نتاج انتقال می­یابد، اطلاق می­گردد. از آنجا که این نوع تنوع، ناشی از عوامل ارثی است و قابلیت انتقال به نتاج را دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامه­های اصلاحی حائز اهمیت است. منشاء تنوع ارثی در گیاهان نوترکیبی­های ژنتیکی، تغییرات در کروموزوم­ها و جهش[8]­ها می­باشد (محسنی­فرد، 1386).
تنوع موجود در یک ژرم­پلاسم می­تواند، منجر به ارقام بهتر و همچنین استفاده از این تنوع در جهت بهبود خصوصیات رقم زراعی گردد (ارزانی، 1380). طراحی و اجرای یک برنامه اصلاح نباتات برای اصلاح یک صفت کمی، تا حد زیادی به میزان تنوع ژنتیکی ژرم­پلاسم بستگی دارد. مطالعه پلی­مورفیسم در میان ژرم­پلاسم، فرصت گزینش والدین مناسب جهت تلاقی را فراهم می­آورد. انتظار می­رود این والدین در تلاقی با هم نتاج برتری تولید کرده و میانگین صفات را در جمعیت بالا ببرند. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین فاصله ژنتیکی نسبی موجود بین افراد یا جمعیت­ها در برنامه­های اصلاحی اهمیت ویژه­ای دارد، زیرا سازماندهی ژرم­پلاسم و گزینش، بطور موثری انجام می­شود. در آغاز یک برنامه اصلاحی، آگاهی از روابط خویشاوندی و فیلوژنی در میان ژنوتیپ­ها تکمیل کننده اطلاعات فنوتیپی، در پیشبرد اصلاحی جمعیت­ها است. همچنین اطلاع از شباهت­های ژنتیکی در بین ژنوتیپ­ها موجب می­شود انتخاب والدین در یک تلاقی، بطور موثرتری انجام پذیرد (نلی[9] و همکاران، 1999).
 1-7-2-فرسایش ژنتیکی[10]
از بین رفتن منابع ژنتیکی یا ذخایر توارثی را فرسایش ژنتیکی گویند (فارسی و باقری, 1383). امروزه ذخایر توارثی گیاهی مهمترین، پرارزش­ترین و حیاتی­ترین ذخایر منابع طبیعی بشر محسوب می­گردند و ارزش مادی و معنوی آنها به هیچ عنوان با سایر ذخایر و منابع طبیعی قابل مقایسه نمی­باشد (وجدانی, 1372). در حدود سال 1950 این نظریه قوت گرفت که منابع ژنتیکی طبیعی به سرعت در حال تخریب می­باشند و یا به اصطلاح فرسایش ژنتیکی اتفاق می­افتد. در حقیقت، فرسایش ژنتیکی در طول ده­ها سال بر اثر سرعت زیاد در تخریب منابع ژنتیکی تداوم یافته است و اگر با همان سرعت پیش می­رفت تا سال 2000 مخازن ژرم­پلاسم طبیعی همه نابود شده بودند (اسمال[11]و همکاران، 1995). بنابراین گیاهان با تمام ارزش­های مادی که برای بشر دارند متاسفانه به دلیل سیستم­های دفاعی ضعیف خود تحت تاثیر عوامل فرساینده منابع ژنتیکی متعددی قرار گرفته و به سرعت به زوال و نابودی کشیده می­شوند.
از مهمترین عوامل فرساینده منابع ژنتیکی می­توان به سوانح طبیعی مانند سیل، آتش­سوزی، چرای بی­رویه حیوانات، بهره­برداری بی­رویه بشر از درختان جنگلی، توسعه شهرنشینی و صنعت، توسعه شبکه راههای مختلف و امکانات حمل و نقل، توسعه کشاورزی مدرن و جایگزینی ارقام اصلاح شده به جای ارقام بومی، اثرات سوء استفاده از نهاده­های کشاورزی مثل سم و کود و بالاخره اثرات سوء استفاده از ماشین­آلات سنگین بر روی بافت خاک و پوشش گیاهی اشاره نمود (وجدانی, 1372).
1-7-3-حفاظت از ذخایر توارثی
ایجاد ارقام برتر از نظر زراعی که به افزایش تولید گندم کمک کرده­اند، بدون استفاده از تنوع ژنتیکی امکان­پذیر نبوده است. آنچه مسلم است این می­باشد که موفقیت آینده متخصصان اصلاح نباتات به حفظ ذخایر ژنتیکی امروز بستگی دارد تا بتوانند از آن در برنامه­های آتی اصلاحی خود استفاده کنند. اصلاح نباتات در صورتی شانس موفقیت در برنامه­های اصلاحی خود را دارد که امکان انتخاب مواد مناسب و تنوع وجود داشته باشد. از طرفی دیگر عوامل فرساینده ژنتیکی مختلفی باعث حذف و نابودی این ثروت خدادادی و پر ارزش شده­اند، بنابراین سرمایه­گذاری برای ایجاد