1- مقدمه. 1
1-2- پپتیدهای ضدمیکروبی 3
1-3- پروتئین لاکتوفرین 3
1-4- هدف 3
2- مروری بر پژوهشهای پیشین. 5
2-1- بیماریهای گیاهی و مهند سی ژنتیک 5
2-2- توتون “سیستم بیان گیاهی متداول” 6
2-3- معرفی پپتیدهای ضد میکروبی 6
2-3-1- پپتیدهای ضدمیکروبی با منشا حشرات. 7
2-3-2- پپتیدهای ضدمیکروبی شناسایی شده در دیگر حیوانات. 7
2-3-3 – پپتیدهای ضدمیکروبی حاصل از سنتز مصنوعی. 7
2-3-4- پپتیدهای ضدمیکروبی حاصل از میکروارگانیسمهای مهندسی شده. 8
2-3-4-1- باکتریها. 8
2-3-4-2- مخمرها. 9
2-3-4-3- گیاهان. 9
2-4- 1- معرفی لاکتوفرین. 11
2-4-2- بررسی ساختار ژنی لاکتوفرین. 11
2-4-3- ویژگی پروتئین لاکتوفرین. 11
2-4-4- نقش پروتئین لاکتوفرین. 12
2-4-5- فعالیت ضد قارچی و ضد باکتریایی پروتئین لاکتوفرین. 12
2-4-6- فعالیت ضد ویروسی پروتئین لاکتوفرین. 13
2-4-7- فعالیت ضد سرطانی پروتئین لاکتوفرین. 13
2-5- ویروس موزاییک خیار(Cucumber mosaic virus) 14
2-6- پژمردگی جنوبی باکتریایی گیاهان تیره سولاناسه 14
3- مواد و روشها. 16
3-1- مواد گیاهی 16
3-2- مایع زنی ویروس موزاییک خیار به توتون رقم زانتا 16
3-3- واکنش گیاهان تراریخت و تیپ وحشی به ویروس موزاییک خیار 17
3-4- آزمون الایزا برای ویروس موزاییک خیار 17
3-5- تایید تراریختی 18
3-5-1- استخراج DNA ی ژنومی. 18
3-5-2- انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده ازDNA ژنومی 20
3-6- تهیه ی ژل آگارز و انجام الکتروفورز. 22
3-7- استخراج RNA 23
3-8- تیمار DNase 25
3-9- سنتز رشته اول cDNA 26
3-10- انجام Real-Time PCR جهت مقایسه ی میزان بیان ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت 27
3-11- انجام Real-Time PCR جهت مقایسهی ژن cp ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت و تیپ وحشی. 29
3-12- باکتری پژمردگی آوندی R. solonacerum. 30
3-12-1- مواد گیاهی. 30
3-12-2-کشت باکتری R. solanacearum و مایه زنی آن به گیاهان تراریخته. 31
4- نتیجه گیری. 33
4-1- مشاهدهی علایم. 33
4-1-1- توتونهای تیپ وحشی. 33
4-1-2- ظهور علایم درتوتونهای تراریخت. 34
4-2- آزمون الایزا. 36
4-2-1- آزمون الایزا زمان صفر(زمان ظهور علایم در تیپ وحشی) 37
4-2-2- آزمون الایزا زمان20روز بعد از مایه زنی ویروس موزاییک خیار. 37
4-3- استخراج DNAگیاهان تراریخت 39
4-3-1- واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تایید وجود ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت. 39
4-4- استخراج RNAو ساخت cDNA 40
4-5- انجام Real Time PCR. 42
4-5-1- انجام Real Time PCR برای ژن لاکتوفرین. 42
4-5-2- انجام Real Time PCR برای ژن cp ویروس موزاییک خیار 43
4-6- مایه زنی باکتری R. solonaserum به توتون. 46
6- بحث. 47
7- منابع. 49
فهرست جدولها
عنوان…………………………………… …………. صفحه
جدول 3-1- محول ضدعفونی کننده بذر توتون.. 16
جدول 3-2- تهیه ی بافر استخراج DNA.. 19
جدول 3-3- پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر و تایید ژن لاکتوفرین 20
جدول 3-4- سیکل گرمایی استفاده شده در هر واکنشPCR 21
جدول 3-5- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR.. 22
جدول 3-6- نوع و میزان مواد به کار رفته برای تیمار DNase. 25
جدول 3-7- مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA.. 26
جدول 3-8- مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA.. 27
جدول 3-9- آغازگرهای به کار رفته ژن لاکتوفرین برای Real-Time PCR و ژن کنترل داخلی.. 27
جدول 3-10- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی…….. 28
جدول 3-11- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن کنترل داخلی.. 29
جدول 3-12- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژنcp ویروس موزاییک خیار و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی.. 30
جدول 3-13- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار و ژن کنترل داخلی.. 30
جدول 4-1- تاخیر ظهور علایم پس از 15 روز از مایه زنی ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت.. 36
فهرست شکل ها
عنوان……………………………………………………………………………………………………………………………… صفحه
شکل 4-1- ظهور علایم در توتون های تیپ وحشی.. 33
شکل 4-2- گیاهان تراریخت هنگام ظهور علایم در تیپ وحشیها.. 34
شکل 4-3- گیاهان تیپ وحشی بعد از 30 روز مایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 34
شکل 4-4- گیاهان تراریخت پس از 15 روز از ظهور علایم در تیپ وحشیها 35
شکل 4-5- آزمون الایزا در زمان صفر.. 37
شکل 4-6- رشد ویروس در تراریخت ها و تیپ وحشی در 20 روز بعد ازمایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 38
شکل 4-7- آزمون الایزا در زمان 30 روز بعد مایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 39
شکل 4-8- نقوش الکتوفروزی محصول PCR با پرایمرهای partial ژن لاکتوفرین.. 40
شکل 4-9- استخراج RNA از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی.. 40
شکل 4-10- نقوش الکتروفورز PCR آغازگرهای Real-Time با آغازگرهای ژن لاکتوفرین:.. 41
شکل 4-11- تیمار DNase توتون تیپ وحشی پس از 22 روز از مایه زنی باکتری.. 41
شکل 4-12- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن لاکتوفرین در لاینهای تراریخت.. 42
شکل 4-13- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار 43
شکل 4-14- کشت عصاره ی حاصل از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی.. 44
شکل 4-15- پژمرده گی گوجه پس از 26 روز از مایه زنی باکتری 45
شکل 4-16- توتون تراریخت 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum.. 45
شکل 4-17- توتون تیپ وحشی 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum.. 45
فصل اول
1- مقدمه
براساس یک تخمین محافظه کارانه، بیماریها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین 31 تا 42% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آنها جلوگیری میکنند. میزان خسارت به طور معمول در کشورهای پیشرفته و در کشورهای در حال پیشرفت که نیاز غذایی بیشتری دارند، بالاتر است (Tisdell and Xiang, 1998). اگر متوسط میزان خسارت را 5/36% بگیریم، سهم بیماری ها، حشرات و علف های هرز دراین خسارت به ترتیب 1/14%، 2/10% و 2/12% شده است. با توجه به اینکه بیماری ها به تنهایی موجب نابودی 1/14% محصولات می شوند، مقدار خسارت سالانه آنها در سطح جهانی بالغ بر220 میلیارد دلار می شود (Wood and Derek, 2001).
طی یک صد سال گذشته، کنترل بیماریها و سایر آفات گیاهی به طور فزایندهای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. کنترل بیماریهای گیاهی اغلب کاربرد این مواد سمی را نه تنها بر روی گیاه و محصولات گیاهی مورد استفادهی ما، بلکه درون خاک جایی که بسیاری از میکروارگانیزمهای بیماریزا زندگی کرده و به ریشهی گیاه حمله میکنند، ضروری ساخته است. بسیاری از این مواد شیمیایی برای میکروارگانیزمهای غیر هدف، حیوانات و حتی برای انسان نیز ممکن است سمی باشند. دشوار است که بتوان هزینههای بلند مدت و کوتاه مدت آلودگی محیط زیست بر سلامتی و بهزیستی انسان را که براثر تلاش ما برای کنترل بیماری های گیاهی و سایر آفات به وجود می آید، تخمین زد. شمار زیادی از بیمارگرهای گیاهی از ویروئیدهای دارای چند صد نوکلئوتیدی تا گیاهان عالی در محصولات کشاورزی ایجاد بیماری میکنند. دامنهی اثرات این بیماری زا از اثرات خفیف تا نابودی کامل محصول است. گروههای عمده بیمارگرها شامل ویروسها، باکتریها، قارچها، اوومیستها، ویروسها و نماتدها میباشند. کنترل عوامل بیماریزای گیاهی مشکل است زیرا جمعیت آنها بسته به زمان، مکان و نوع ژنوتیپ متغیر است. بنابراین برای مبارزه با تلفاتی که آنها به وجود می آورند، لازم است به تعریف مشکل پرداخت و به دنبال راهحلهایی بود. در سطح زیستی نیاز به روشهایی برای تشخیص دقیق و سریع اورگانیزم ایجاد کنندهی، بیماری تخمین دقیق شدت بیماری، اثر بیماری روی محصول و تشخیص مکانیسم های بیماریزایی میباشد. در مرحلهی بعد خسارت بیماری باید به وسیلهی کاهش مایه تلقیح بیمارگر، کاهش مکانیسم های بیماریزایی آن و افزایش گوناگونی ژنتیکی در محصول به حداقل برسد (Reed et al., 2003). هدف بیشتر پژوهشهای جدید در بیماریشناسی گیاهی یافتن شیوههای دیگر برای کنترل بیماریهای گیاهی است که به محیط زیست آسیب کمتری برسانند. روشهای انتقال در سالهای اخیر به عنوان یک موضوع مهم برای ایجاد مقاومت مورد بررسی قرار گرفته است. امید بخشترین این روشها عبارتند از:
تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق مهندسی ژنتیک
تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق بهنژادی گیاهی سنتی
کاربرد فنون زراعی برای سرکوب بیماری
کاربرد فنون خاموشی ژن
استفاده از مواد غیر سمی افزایش دهندهی مقاومت
بهرهوری از عوامل زیستی ناهمساز به میکرواورگانیزمهای مولد بیماری (ایزدپناه و همکاران، 1389 و Strange et al., 2005)
با توجه به ضرورت ارقام گیاهی مقاوم به تنشهای زیستی و غیر زیستی و نارسایی روشهای سنتی بهنژادی گیاهی، به کارگیری روشهای موثر تنها راه برون رفت از این مشکل میباشد. در سالهای اخیر، با پیشرفت بدست آمده از در زیست شناسی مولکولی و روشهای کشت بافتی گیاهی روشهای جدیدتر و کارآمدتری را در مهندسی ژنتیک، برای چیرهگی بر محدودیتهای بهنژادی گیاهی سنتی فراهم کرده است. بنابراین استفاده از مهندسی ژنتیک برای دستیابی به ارقام مفید می باشد. با استفاده از فنون انتقال ژن، گیاهان تراریخت با یک ویژگی مشخص می توانند یک ژن از منبع ژنی متفاوت دریافت نمایند به نحوی که سایر ویژگیهای مطلوب گیاه تحت تاثیر قرار نگیرد. بنابراین کاربرد سموم شیمیایی هنوز موثرترین روش برای کنترل بیماریهای گیاهی هستند، اما کاربرد بیش از اندازهی باکتریکشها و قارچکشهای شیمیایی منجر به شدید شدن و طولانی شدن دورههای آلودگی محیط زیست و مقاوم شدن بیمارگرها نسبت به این سموم شده است (Daoubi et al., 2005). اگرچه روشهای اصلاحی یکی از موثرترین راهکارها در تولید گیاهان مقاوم به بیماریها بوده اما این روش دارای محدودیتهایی مانند فقدان پل ژنی دهندهی مناسب و شکستن مقاومت میباشد. از سوی دیگر روشهای بیوتکنولوژی به طور موفقیتآمیزی در تولید محصولات گیاهی مقاوم علیه بیمارگرها و آفات موثر بوده است، در این روشها ژن بیان کنندهی پپتیدهای ضدمیکروبی را در گیاهان بیان کرده و باعث مقاومت گیاه به بیماری مورد نظر شده است (Tingquan et al., 2013).
1-1- پپتیدهای ضد میکروبی
پپتیدهای ضد میکروبی یکی از اجزای سیستم ذاتی ایمنی محسوب میشود که معمولا به عنوان اولین خط دفاعی علیه پاتوژنها عمل میکنند. چند ویژگی که معمولا در همهی پپتیدهای ضد عمومیت دارد شامل: توالی کوتاه بین 30 تا60 اسید آمینه آمینه، خاصیت کاتیونی قوی، قابلیت تحمل دما تا 100 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه میباشد. پپتیدهای ضد میکروبی بوسیلهی موجودات مختلف تولید میشوند که شامل باکتریها حشرات، گیاهان و مهره داران می باشد (Boulanger et al., 2006). پپتیدهای ضد میکروبی طیف وسیعی از میکروارگانیسمها شامل باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی، قارچها، میکروپلاسماها و ویروسها را کنترل میکنند. بیش از 1500 پپتید ضد میکروبی در جانوران، گیاهان و میکروارگانیسمها شناسایی شده است (Parachin et al., 2012 ; Li et al., 2012).
بیان ژنهای کد کنندهی پپتیدهای ضدمیکروبی با منشا گیاهی در گیاهان تراریخته باعث تغییر کمی در مقاومت گیاه علیه بیمارگرهای گیاهی می شود، زیرا بیمارگر با گیاه در یک مدت طولانی با هم تکامل یافتهاند اما بیان ژن های کد کننده یپپتیدهای ضدمیکروبی از منابع دیگر در گیاهان منجر به سطح بالایی از مقاومت در برابر طیف وسیعی از بیماریها شده است (Burrowes et al., 2005).
1-2- پروتئین لاکتوفرین
پروتئین لاکتوفرین یکی از اعضای خانوادهی ترانسفرین ها می باشد که دارای خاصیت اتصال شوندهگی به آهن است. لاکتوفرینها اغلب آمفیپاتیک حاوی بار مثبت و مناطق هیدروفیل هستند که به دومین مولکولهای حاوی بار منفی در سطح میکرواورگانیسم متصل میشوند که این مکانیسم به لاکتوفرین اجازه میدهد به راحتی با غشا باکتری که شامل مجموعهای از مولکولهای آمفیپاتیک میباشد، واکنش دهد، مخصوصا با باکتریهایی که سطح غشا آنها دارای بار منفی میباشند (Legrand and Mazurier, 2010 ).
1-3- هدف
در این پروژه بیمارگرهای باکتریایی و ویروسی به گیاهان ترایخت نسل دوم توتون حاوی ژن لاکتوفرین شتر عربی با هدف ایجاد مقاومت توتونهای تراریخت نسبت به این بیمارگرها مایهزنی گردید.
فصل دوم
2- مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- بیماریهای گیاهی و مهند سی ژنتیک
با تشخیص القای تومور درگیاهان توسط Agrobacterium tumefaciens بهواسطهی انتقال T-DNA موجود روی پلاسمید باکتری ایجاد میشود، کاربرد از آن برای ایجاد گیاهان تراریخت معمول شده است. اگر چه از تکنیکهای دیگری مانند الکتروپوراسیون[1] و بیولیستیک[2] نیز استفاده میشود. روش های سنتی بهنژادی گیاهان شامل تلاقیهای مختلف و روشهای درون شیشهای مکمل این روشها در ایجاد گیاهان با صفات مطلوب میباشند. در سالهای اخیر ظهور روشهای مهندسی ژنتیک به عنوان ابزاری جدید در تحقیقات کشاورزی همسو با بهنژادی سنتی در گسترش روشهای جدید برای دستورزی ژنتیکی گیاهان نقش بسیار مهمی ایفا کرده است. یکی از شاخههای زیست فناوری گیاهی انتقال ژنهای خاص به سلولهای گیاهی و یا بازایی گیاه از این سلولها با استفاده از روشهای کشت بافت گیاه میباشد. بنابراین زیست فناوری این پتانسیل را دارد که با تولید گیاهان با خصوصیات بهبود یافته مکمل روشهای سنتی به نژادی گیاهان شود. بر خلاف روشهای به نژادی سنتی که در آّن دستهای از ژنها منتقل میشود (Wood and Derek, 2001). در روشهای مبتنی بر زیست فناوری میتوان یک ژن مشخص را از هر موجودی انتخاب و به جاندار دیگر انتقال داد. سوالی که در روشهای مهندسی ژنتیک مطرح میشود این است که چه ژنهای باید منتقل شوند که پاسخ به این سوال بستگی به نوع هدفی که در انتقال ژن دنبال می شود، دارد. در مبارزه با بیماریها با استفاده از مهندسی ژنتیک دسته اول ژنهای کاندیدا برای انتقال ژنهای هستند که ویژگیهای بیماریزای بیمارگر به عنوان مثال آنزیمهای تجزیه کننده توکسینها را باز داشته یا آن را از بین میبرند یا ژنهایی که مقاومت گیاه را افزایش میدهند. دسته بعدی ژنهایی هستند که غلظت پپتیدهای ضدمیکروبی را افزایش میدهند (Strange et al., 2005).
ژنهای جانوری که از آنها می توان برای ایجاد مقاومت در گیاهان استفاده کرد بسیار متنوع هستند که از حشرات، پستانداران و خزندگان قابل جداسازی هستند به عنوان نمونه سکروپین[3] و دفنسین[4] حشرات، برنینز[5] قورباغه، ایندولوسیدین[6] گاو نمونههایی از پروتئینهای ضد میکروبی هستند که ژن آنها قابل انتقال به گیاهان است (Li et al., 2012). از دیگر ژنهای با خواص ضدمیکروبی می توان به لاکتوفرین و لیزوزیم پستانداران اشاره کرد.
2-2- توتون “سیستم بیان گیاهی متداول”
توتون با نام علمی Nicotiana tabacum به عنوان یک سیستم بیان گیاهی مدل است که در سطح گسترده، جهت انتقال ژنهای مختلف بکار رفته است و بیشترین استفاده را در بین گونههای گیاهی به خود اختصاص داده است. از بهترین دلایل انتخاب آن، می توان به انعطافپذیری و آسانی نسبی دستورزی ژنتیکی، ایجاد عملکرد سالانه بیش از 100 تن در هکتار و تولید بذر فراوان در گیاه اشاره کرد (Strange et al., 2005).
توتون یک محصول خودگرده افشان است و خویشاوندان زراعی یا وحشی کمی دارد. بنابراین امکان فرار ژن در این حالت بسیار کم است و بنابراین بر خلاف بسیاری از سیستمهای گیاهی، توتون مناسبترین شرایط را از نظر مسایل ایمنی زیستی و اخلاق زیستی دار است و کمترین احتمال آلودگی زنجیرههای گیاهی و جانوری را داراست )قاسم پور و همکاران، 1386).
2-3- معرفی پپتید های ضد میکروبی
پپتیدهای ضد میکروبی بوسیلهی موجودات مختلف تولید میشوند که شامل باکتریها حشرات، گیاهان و مهره داران میباشند (Boulanger et al., 2006). همانطور که قبلا بحث شد چند روش برای گسترش تولید [7]AMPدر سیستمهای میکروبی وجود دارد که از جملهی آن به کنترل رونویسی و تولید پروتئین نوترکیب میباشد، اما سیستم بیانی گیاهان به عنوان یک جایگزین مناسب برای تولید پپتیدها بدون نیاز به کنترل رونویسی، توانایی بیان در سطح بالا و فرایندهای پس از ترجمه گیاه می باشد مورد توجه قرار گرفتهاند (Haung et al., 2009). این پپتیدهای دارای شش سیستئن در توالی خود میباشند که تشکیل سه باند دیسولفیدی میدهند (Craik, 2011). این کمپلکس ساختار سه تایی از طریق پیشسازش جداشده، خارج میشود و تا میخورد که نتیجهی آن تولید پپتید بالغ میباشد. و پیشنهاد شده که پپتید اولیه به همراه یک آنزیم واکوئلی به نام آسپارزینیل اندوپپتیداز[8] با دو فعالیت اندوپپتیدازی و تشکیل ساختار صحیح پروتئین این فرایند را انجام میدهد (Craik et al., 1999).
پپتیدهای ضدمیکروبی با توجه به منشاشان به چهار گروه تقسیم بندی میشوند:1- حشرات 2- دیگر حیوانات 3- شیمیایی 4- از طریق میکروارگانیسمهای مهندسی شده تولید میشوند. امروزه بیش از 1500 پپتید ضدمیکروبی از منشاهای متفاوت گزارش شده است (Varadhachary and Gauri, 2010).
2-3-1- پپتید های ضد میکروبی با منشا حشرات
این نوع پپتیدها هم القایی هستند و هم به صورت همیشه بیان میباشند. امروزه بیش از 200 پپتید در حشرات شناسایی شده این پپتیدها به پنج گروه بر اساس توالی اسید آمینه و فعالیت آنتی باکتریایی تقسیم بندی می شوند. که عبارتند از سکروپینها، دفنسین حشرات، پپتید غنی از پرولین، پپتیدهای غنی از گلیسین و لیزوزیمها(Li et al., 2012) .
2-3-2- پپتیدهای ضد میکروبی شناسایی شده در دیگر حیوانات
این پپتیدها توالی متنوع، ساختار و بافت هدف خاصی را نشان میدهند. بیان این پپتیدها در اکثر بافتها و انواع مختلفی از سلولها و سطح گستردهای از انواع گونههای مختلف شامل پستانداران، دوزیستان و ماهیها بیان می شوند. در بیشتر مهرهداران با یک لایهی دایرهای خنثی حفظ میشود (Li et al., 2012).
2-3-3 – پپتید های ضد میکروبی حاصل از سنتز مصنوعی
سنتز مصنوعی با استفاده از روش فاز جامد انجام میگیرد که در این روش ابتدا اسید آمینهای که انتهای آن دارای انتهای آمینی میباشد، محافظت شده به فاز جامد متصل میشود سپس مولکولی که به قسمت انتهای آمینی چسبیده برداشته شده و اسید آمینهی دیگر اضافه شده و به همین ترتیب ادامه داده تا پپتید مورد نظر ساخته شود. ازجمله مشکلات سر راه در سنتز پپتید هزینهی زیاد، وجود باندهای دیسولفیدی و تغییرات پس از ترجمه می باشد (Wang et al., 2012).
2-3-4- پپتیدهای ضد میکروبی حاصل از میکروارگانیسمهای مهندسی شده
پیشرفت در تکنولوژی DNAی نوترکیب فرصتی را برای تولید AMPها در مقیاس وسیع فراهم کرده است. این تکنولوژی قادر است ژن بیگانه را در ناقل های مخصوص جاسازی و در پروکاریوتها و سلولهای یوکاریوت میزبان بیان کند. با توجه به اینکه موثرترین روش برای صرفهجویی در زمان و کاهش هزینه میباشد و علاوه بر این تولید پپتید با استفاده از تکنیک زیست مولکولی میتواند در بخشهای مختلف صنعتی به کاررود (Rao et al., 2005). با توجه به اندازهی پپتید، جایگاه و ترشح داخل سلولی پپتید، نحوهی تاخوردهگی و الگوهای قنددار شدن پپتیدها، میزبانهای متفاوتی وجود دارد. باکتریها و مخمرها 96 درصد میزبانها را در تولید AMPها به خود اختصاص دادند و درحالی که گیاهان نقش کمرنگ تری در تولید AMP ها دارند (Parachin et al., 2012).
2-3-4-1- باکتری ها
باکتری Esheria coliیکی از پر کاربردترین میکرو ارگانیسمها برای تولید پپتیدهای ضد میکروبی میباشند که به دلیل رشد سریع، دسترسی به ناقل های بیانی تجاری، وجود دانش وسیع در حیطهی ژنتیک، بیوشیمی و فیزیولوژی را به خود اختصاص داده است. بعد از E.coli باکتری Bacillus subtillusبیشترین کاربرد برای بیان AMP را به خود اختصاص داده است (Ingham and Moore, 2007) که از جملهی آن می توان سکروپین AD نام برد (Feng et al., 2012). تولید AMP در باکتریها با چند چالش روبرو میباشد، از جمله می توان، جلوگیری از فعالیت طبیعی AMP به دلیل سمی بودن برای باکتری و ناپایداری AMP به علت خواص شیمیایی و اندازهی آن نام برد. بنابراین برای بدست آوردن بیان موفقAMP از یک پروتئین حامل که خاصیت آنیونی پپتید را خنثی کند میتوان از پروتئین حامل استفاده کرد، علاوه بر این، پروتئین حامل حلالیت AMP را تسهیل کرده است (Li et al., 2012).
2-3-4-2- مخمرها
مخمرهایی مانند Saccharomyces cerevisiae و Pichia pastoris از جمله میزبانهای مناسب برای تولید AMPها می باشند (Cregg et al., 2009). مخمرها مزایایی نسبت به پروکاریوتها دارند که عبارتند از: دارای تغییرات پس از ترجمه هستند، هزینهی کمتر و رشد سریعتر در مقایسه با کشت سلولهای پستانداران دارند که نتیجهی آن تولید پروتئین بیشتر و مناسبتر میباشد و در نهایت اینکه مخمر ها قادرند AMPمورد نظر را به بیرون ترشح کنند که خالصسازی و جداسازی را آسان میکند (Atiqur et al., 2010). برای مثال تولید AMPی Shrimp paenedin در S.cerevisiae انجام شد ولی سطح تولیدی گزارش نشد در حالی که درP .pastoris مقدار mg/l-1180 تولید شد. دلیل آن این است که P. pastoris دارای مقاومت نسبت به الکل می باشد و محیط اطراف خود را تخمیری نمیکند بنایراین می تواند سطح بالایی از پپتید را تولید کند (Cereghino et al., 2002).
1Electroporation
[سه شنبه 1398-07-30] [ 01:50:00 ق.ظ ]
|