چکیده
اوكالیپتول یک مونوترپن است که در اسانس روغنی بسیاری از گیاهان از جمله گیاه اوکالیپتوس وجود دارد. این ترکیب اثرات فارماکولوژیک متنوعی نشان میدهد که بسیاری از آنها برهمکنش مستقیم یا غیر مستقیم با کانالهای یونی را بکار میگیرد. در این تحقیق تاثیر اکالیپتول بر تحریکپذیری نورونهای کانگلیون زیرمری حلزون Caucasotachea atrolabiata با استفاده از تکنیک ثبت داخل سلولی مطالعه شد. اوکالیپتول (3 میلی مولار) پس از حدود 5 دقیقه، منجر به افزایش فرکانس پتانسیلهای عمل و کاهش دامنه و مدت پتانسیل متعاقب هیپرپلاریزان گردید که میتواند بیانگر مهار جریانهای پتاسیمی رو به خارج باشد. اعمال دارو در غلظت بالاتر (mM5) سبب تغییر الگوی فعالیت نورون از حالت منظم به فعالیت انفجاری به همراه انحراف دپلاریزان گردید که این تغییرات بعد از شستشو با رینگر نرمال برگشتپذیر بود. اعمال اوکالیپتول 3 میلی مولار پس از کاربرد مهارکنندههای سنتتیک کانالهای پتاسیمی، تترااتیلآمونیوم (مهارکننده کانالهای پتاسیمی جبرانکننده تأخیری) و 4-آمینوپیریدین (مهار کننده کانالهای پتاسیمی سریع) منجر به القای فعالیت انفجاری شد که از عملکرد همسوی اوکالیپتول با این عوامل حمایت میکند. فعالیت انفجاری و انحراف دپلاریزان در حضور نیفدیپین (مهارکننده کانالهای کلسیمیL-type) و نیکل کلراید (مهارکننده غیراختصاصی کانالهای کلسیمی) حذف شد که میتواند بیانگر نقش جریانهای کلسیمی رو به داخل در تعدیل فعالیت نورونی توسط اکالیپتول باشد. H89 (مهار کننده پروتئین کیناز وابسته بهcAMP ) و کلریترین (مهارکننده پروتئین کینازC) قادر به مهار قابل توجه فعالیت انفجاری و انحراف دپلاریزان نبودند که نشان میدهند فعالیت صرعی القاء شده توسط اکالیپتول به فسفوریله شدن کانالها وابسته نیست. نتایج تحقیق حاضر نشان میدهد که به احتمال زیاد اوکالیپتول بواسطهی مهار مستقیم کانالهای پتاسیمی تحریکپذیری نورونها را افزایش میدهد.
کلمات کلیدی: اوکالیپتول، نورون حلزون، فعالیت انفجاری، انحراف دپلاریزان، کانالهای یونی
فهرست مطالب
عنوان ………………………………………………………………………………………………………………………………. صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1) بیان مساله …………………………………………………………………………………………………………………………2
1-2) دلایل استفاده از نورونهای حلزون ………………………………………………………………………………… 6
فصل دوم: مروری بر تحقیقات پیشین
2-1) صرع …………………………………………………………………………………………………………………………………. 9
2-2) اسانسهای گیاهی ………………………………………………………………………………………………………… 10
2-3) اثرات بیولوژیک اسانسهای گیاهی ……………………………………………………………………………… 12
2-4) ترکیبات اسانسها و عملکرد آنها روی سیستم عصبی مرکزی و محیطی ………………… 12
2-4-1) کامفر ………………………………………………………………………………………………………………………… 13
2-4-2) منتول ……………………………………………………………………………………………………………………….. 13
2-4-3) لینالول ……………………………………………………………………………………………………………………… 14
2-4-4) اوکالیپتول ………………………………………………………………………………………………………………… 15
2-5) کانالهای یونی و مشارکت آنها در فعالیت الکتریکی نورونها ………………………………….. 17
2-5-1) کانالهای کلسیمی …………………………………………………………………………………………………… 18
2-5-2) کانالهای پتاسیمی ………………………………………………………………………………………………….. 20
2-5-2-1) کانالهای پتاسیمی وابسته به ولتاژ …………………………………………………………………….. 21
2-5-2-2) کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم …………………………………………………………………. 21
2-5-3) کانالهای سدیمی ……………………………………………………………………………………………………. 23
2-5-3-1) جریانهای سدیمی گذرا و مداوم ……………………………………………………………………….. 23
2-6) پروتئین کینازها و تنظیم کانالهای یونی توسط فسفوریلاسیون ……………………………….. 24
2-6-1) PKA و اثر بر کانالهای یونی ………………………………………………………………………………….. 25
2-6-2) PKC و اثر بر کانالهای یونی ………………………………………………………………………………….. 26
فصل سوم: مواد و روشها
3-1) حیوانات …………………………………………………………………………………………………………………………. 29
3-2) تشریح و آماده سازی گانگلیون عصبی جهت ثبت ………………………………………………………. 30
3-3) محلولها و داروها …………………………………………………………………………………………………………. 31
3-4) ثبت داخل سلولی …………………………………………………………………………………………………………. 31
3-5) مراحل آزمایش ……………………………………………………………………………………………………………… 33
3-6) پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد مطالعه ………………………………………………………………….. 33
3-7) آزمون آماری …………………………………………………………………………………………………………………. 35
فصل چهارم: نتایج
4-1) ویژگیهای فعالیت خودبخودی و برانگیخته نورونهای حلزون در شرایط کنترل ……… 37
4-2) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی نورونهای حلزون در حضور غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 38
4-3) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی نورونهای حلزون در حضور غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 44
4-4) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 3 میلی مولار و PTZ ……. 49
4-5) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 3 میلی مولار و مهار کنندههای کانالهای پتاسیمی 4-AP و TEA ………………………………………………………………………. 50
4-6) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 5 میلی مولار و مهار کنندههای کانالهای کلسیمی نیکل کلرید و نیفدیپین ………………………………………………………… 52
4-7) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 5 میلی مولار و مهار کنندههای پروتئین کینازها کلریترین و H89 ……………………………………………………………………….. 54
فصل پنجم: بحث و نتیجهگیری
5-1) بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………… 58
5-1-1) تغییر در ویژگیهای پتانسیل عمل در حضور اوکالیپتول ……………………………………….. 59
5-2) نتیجهگیری …………………………………………………………………………………………………………………… 63
5-3) پیشنهادات برای مطالعات آینده …………………………………………………………………………………… 64
فهرست منابع و ماخذ ……………………………………………………………………………………………………………… 65
فهرست شکلها
عنوان ………………………………………………………………………………………………………………………………. صفحه
شکل 3-1. حلزون باغی …………………………………………………………………………………………………………. 29
شکل 3-2. گانگلیون تحت مری تثبیت شده در محفظه ثبت ……………………………………………… 30
شکل 3-3. نمایی از وسایل ثبت داخل سلولی ………………………………………………………………………. 32
شکل 3-4. نحوه اندازه گیری برخی پارامترهای پتانسیل عمل ……………………………………………. 34
شکل 4-1. الگوی فعالیت خودبخودی نورون در شرایط کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از مجاورت با اوکالیپتول 3 میلی مولار …………………………………………………………………………………………………….. 38
شکل 4-2. مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار ……………………………………………………………………………………………. 42
شکل 4-3. الگوی فعالیت خودبخودی در شرایط کنترل، 5 دقیقه پس از مجاورت با غلظت mM 5 اوکالیپتول و پس از شستشوی محفظه حاوی اوکالیپتول با رینگر نرمال حلزون ……. 44
شکل 4-4. مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در زمانهای کنترل، 5دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار و پس از شستشو ……………………………………………………………………………. 48
شکل 4-5. پس از افزایش فعالیت نورون درنتیجه افزودنPTZ 10 میلی مولار، افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار بعد از 3 دقیقه منجر به بروز الگوی burst شد …………………………….. 50
شکل 4-6. پس از افزایش فعالیت نورون درنتیجه افزودن TEA 5 میلی مولار، افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار بعد از 5 دقیقه منجر به بروز الگوی burst شد ……………………………. 51
شکل 4-7. پس از افزایش فعالیت نورون درنتیجه افزودن 4-AP 1 میلی مولار، افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار بعد از 4 دقیقه منجر به بروز الگوی burst شد ……………………………. 52
شکل 4-8. پس از بروز فعالیت PDS درنتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، NiCl به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 53
شکل 4-9. پس از بروز فعالیت PDS در نتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، نیفدیپین به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 54
شکل 4-10. پس از بروز فعالیت PDS در نتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، کلریترین به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 55
شکل 4-11. پس از بروز فعالیت PDS در نتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، H89 به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 56
فهرست نمودارها و جدولها
عنوان ………………………………………………………………………………………………………………………………. صفحه
نمودار 4-1. مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء، آستانه، فرکانس و دامنه پتانسیل عمل در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (7=n) ………………………………………………………………………………………………………………. 39
نمودار 4-2. مقایسه میانگین مدت زمان پتانسیل عمل، فاصله بین پتانسیلهای عمل، و سطح زیر منحنی در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (7=n) …………………………………………………………………………….. 40
نمودار 4-3. مقایسه دامنه AHP و طول مدت AHP در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (7=n) …………………………… 41
نمودار 4-4. مقایسه میانگین شیب فاز دپلاریزاسیون و شیب فاز رپلاریزاسیون بین سه حالت کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار (7=n) ………………………………… 42
نمودار 4-5. مقایسه میانگین مدت دوره مهاری بعد از فعالیت برانگیخته پس از تزریق جریانهای دپلاریزان (nA3-2) در شرایط کنترل و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال ……………………………………………………………………………….. 43
نمودار 4-6. مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء، آستانه، فرکانس و فاصله بین پتانسیلهای عمل در شرایط کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (6=n) ……………………………………………………………………………………………….. 45
نمودار 4-7. مقایسه دامنه و طول مدت پتانسیلهای عمل و همچنین سطح زیر منحنی در شرایط کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (6=n) ……………………………………………………………………………………………………………………………………… 46
نمودار 4-8. مقایسه مدت فاز دپلاریزاسیون و رپلاریزاسیون پتانسیل عمل، دامنه AHP و طول مدت AHP در شرایط کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (6=n) ……………………………………………………………………………………………………. 47
نمودار 4-9. مقایسه میانگین شیب فاز دپلاریزاسیون و شیب فاز رپلاریزاسیون بین حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار (7=n) ……………………………………….. 47
جدول4-1. مقاومت ورودی سلول در شرایط کنترل و 10 دقیقه پس از کاربرد اوکالیپتول 3 میلی مولار ………………………………………………………………………………………………………………………………. 43
جدول 4-2. مقاومت ورودی سلول در شرایط کنترل و 10 دقیقه پس از کاربرد اوکالیپتول 5 میلی مولار ………………………………………………………………………………………………………………………………. 49
بیان مساله
بیماری صرع[1] از جمله شایعترین اختلالات عصبی در جهان است. این اختلال بصورت تشنجات خودبخودیِ غیرقابل پیشبینی بروز می کند. صرع معمولاً در نتیجه کاهش عوامل مهاری یا افزایش شدید تحریکپذیری در بخشی از شبکه نورونی مغز رخ میدهد. در چنین شرایطی الگویی از فعالیت غیرطبیعی و شدید موسوم به الگوی فعالیت صرعی در این مجموعه نورونی شروع میشود (Fisher, 1989). تغییر در الگوی فعالیت سیناپسها و اختلال در عملکرد کانالهای یونی بعنوان دو مکانیسم اساسی زمینه ساز صرع شناخته شدهاند (Noebels, 2003; .Wuttke and Lerche, 2006) شواهد متعددی تغییر در سیستمهای نوروترنسمیتری مختلف بویژه گلوتامات، آسپارتات و GABA در ایجاد زمینه صرع را تایید کردهاند (Pinto et al., 2005) با این حال شواهدی وجود دارد که تاثیر انحصاری سیناپسها در ایجاد زمینه و بروز صرع را نقض میکنند. برخی تک سلولهای کشت داده شده بیمهرگان و مهرهداران قادر به تولید الگوی فعالیت صرعی هستند (Rosalin, 1991). همچنین مهار انتقال سیناپسی با غلظت بالای منیزیم و غلظت پایین کلسیم در مواردی قادر به مهار فعالیت صرعی نیست (Bikson et al., 1999). مدارکی از این دست اهمیت و نقش ویژگیهای ذاتی غشاء بویژه عملکرد کانالهای سدیمی، پتاسیمی و کلسیمی در بروز الگوی صرع را نشان میدهند.
با درمانهای موجود در 80% موارد میتوان حملات تشنج را کنترل کرد. علیرغم تولید تعداد قابل توجه داروهای سنتتیک موثر در درمان انواع صرع، تاثیرات جانبی قابل توجه این داروها و نیز عدم کارایی آنها در مورد برخی از مبتلایان باعث شده تا شناسایی ترکیبات ضد صرعِ موثرتر با اثرات جانبی کمتر همچنان مورد توجه بسیاری از محققان باشد (Emamghoreishi and Heidari-Hamedani, 2008).
در طب سنتی استفاده از عصاره خام گیاهان، به صورت خوراکی یا موضعی، نقش مهمی در درمان بسیاری از بیماریها، خصوصاٌ کنترل عفونتها داشت (Navarro et al., 1996). امروزه نیز گیاهان دارویی به عنوان یک منبع مناسب برای یافتن داروهای جدید مورد توجه محققان در سراسر دنیا قرار گرفتهاست. همچنین علاوه بر استفادههای بالینی، محصولات طبیعی مذکور به منظور کشف اهداف جدیدی از جمله رسپتورها و کانالها، حائز اهمیتاند (Vriens et al., 2008).
اسانسهای گیاهی[2] ترکیباتی بودار، فرار، اکثرا روان هستند که در چربی، الکل، حلالهایی با قطبیت ضعیف و به مقدار خیلی کم در آب قابل حل میباشند. این ترکیبات بی رنگ یا زرد کمرنگ و به ندرت دارای رنگ بنفشاند که در ساختارهای ترشحی برخی گیاهان ذخیره شده و قابل استخراج از بخشهای مختلف این گیاهان هستند. اسانسها به طور معمول از ترپنهای[3] آروماتیک فرار و فنیل پروپانوئیدها تشکیل شدهاند که بواسطه عبور آزادانهشان از غشاء سلول میتوانند نقشهای سیگنالینگ متنوعی در سلول داشته باشند. در این ارتباط گزارشهایی حاکی از مداخله ترکیبات اسانسهای گیاهی با کانالهای یونی و رسپتورها نیز وجود دارد (Goncalves et al., 2008).
تعداد معدودتری از مطالعات بر تاثیر خاص برخی ترکیبات از جمله مونوترپنها[4] متمرکزند که در تعداد قابل توجهی از فراوردههای گیاهی موثر بر صرع حضور دارند. مونوترپنها ترکیباتی با فرمول مولکولی C10H16 میباشند که هم در فراوردههای گیاهی صرع زا[5] و هم در فراوردههایی با اثرات ضدصرع یافت میشوند (Burkhard et al., 1999; Ishida, 2005). انواع عصارههای گیاهی و اسانسهای روغنی استخراج شده از گیاهان جهت درمان صرع استفاده میشود. تحقیقات روی این گیاهان نشان داده که عصارههای آنها حاوی ترکیباتی با خواص ضدتشنجی هستند و قادر به