سال تحصیلی 1393-1392
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه ..1
مقدمه: 2
فصل دوم: کلیات و مروری بر مطالعات گذشته….8
2-1- تاریخچه. 9
2-2- طبقه بندی.. 15
2-3- ساختمان ویریون. 16
2-4- ساختمان و سازماندهی ژنوم. 16
2-5- تکثیر ویروس… 18
2-5-1- اتصال ورود ، پوشش برداری.. 19
2-5-2- پروموترهای ویروسی و تنظیم نسخه برداری.. 19
2-5-3 – سرهم بندی و رها شدن ویروس… 21
2-5-4- همانند سازی DNA ویروس… 21
2-6- الحاق DNA ویروسی در ژنوم انسان. 23
2-7- پروتئین های ویروسی.. 24
2-7-1- پروتئین های اولیه E1 تا E6.. 24
2-7-2- پروتئین E7.. 25
2-7-3- پروتئین های L1 و L2.. 28
2-8- تیپ بندی پاپیلوماویروس ها 29
2-9- بیماری زایی.. 29
2-9-1- عفونت پوستی.. 30
2-9-2- عفونت حفره دهانی.. 31
2-9-3- عفونت مجاری تنفسی.. 31
2-9-4- سرطان مقعد. 31
2-9-5- سرطان گردن رحم. 32
2-9-6- HPV در کودکان. 34
2-10- اپیدمیولوژی.. 35
2-11- مطالعه سرطان گردن رحم و عفونت پاپیلوماویروس در ایران. 37
2-12- تشخیص…. 38
2-13- پاسخ ایمنی در برابر HPV.. 40
2-13-1- ایمنی اختصاصی.. 41
2-13-1- 1- پاسخ ایمنی هومورال. 41
2-13-1-2- پاسخ ایمنی سلولی.. 42
2-13-2-پاسخ ایمنی ذاتی.. 43
2-14- درمان. 44
2-15- پیشگیری.. 45
2-16- واکسیناسیون. 46
2-17- واکسیناسیون علیه HPV.. 47
2-17-1- واکسن های نوترکیب با ناقل زنده 50
2-17-2-واکسن های پروتئینی و پپتیدی.. 51
2-17-3-ذرات شبه ویروس( VLPs). 52
2-17-4- DNA واکسن ها 56
-5-17-2 واکسن های خوراکی.. 59
2-18- اهمیت پاسخ های ایمنی هومورال و واکسن های پیشگیری کننده 63
2-19- اهمیت پاسخ های ایمنی سلولی و واکسن های درمان کننده 64
2-20-ایمونوانفورماتیک در علم واکسن.. 65
2-20-1-ﭘﺎﯾﮕﺎه های داده ها (Databases) 68
2-20-1-1- پایگاه های داده اﯾﻤﻮﻧﻮﻣﯿﮏ… 68
2-20-1-2- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B.. 69
2-20-1-3- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلT.. 72
2-20-2-اﺑﺰارها و اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ.. 73
2-20-2-1-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B.. 74
2-20-2-2-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ. 75
2-20-2-3-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ.. 77
2-20-2-4-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B.. 78
2-20-2-5-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T.. 82
2-20-3- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ.. 83
2-21-واکسن همگانی (Universal vaccine) 84
2-22- واكسن سازی معكوس Reverse Vaccinology.. 84
2-23-ادجوانت ها 86
2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر. 89
2-25-کلونینگ ژن. 90
2-25-1- مراحل کلون کردن ژن. 90
2-25-2- میزبان کلونینگ… 90
2-26- آنزیم های محدود کننده 91
2-26-1-آنزیم لیگاز. 91
2-27- حامل های کلونینگ… 91
2-28-غربالگری وجود ژن. 92
2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی.. 92
2-30-وکتورهای بیان کننده 94
2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET.. 94
2-31-وکتورهای پلاسمیدی.. 96
2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno) 97
2-33-استراتژی بیان در سیستمpET.. 97
2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+) 98
2-35-تولید پروتئین نوترکیب.. 99
2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 99
2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli. 100
2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 101
2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب.. 102
2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق.. 103
2-40-1 -فرضیات.. 103
2-40-2 – هدف از انجام تحقیق.. 103
فصل سوم: مواد و روش ها…104
3-1-مجموعه توالی های پروتئین.. 105
3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 105
3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال. 106
3-4-محل های N-Glycosylated.. 107
3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان. 107
3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon) 108
3-7-تولید ساختار واکسن.. 109
3-8-تهیه باکتری مستعد شده 109
3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی.. 111
3-10- SDS-PAGE. 114
3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم. 115
3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی.. 117
3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا. 117
3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS. 119
3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350.. 122
3-15-1- روش تهیه محلول ها 122
3-15-2- روش رنگ آمیزی.. 123
3-16- وسترن بلاتینگ… 123
3-16-1- انتقال در تانک… 124
3-16-2- مسدودسازی غشا 125
3-16-3- تشخیص با آنتی بادی.. 125
3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA.. 126
3-18-بهینه سازی تخلیص…. 127
3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 127
3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 128
3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده 134
3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده 136
3-23- روش برادفورد. 136
3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز. 137
3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد. 137
3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000μic/ml. 137
3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mic/ml 137
3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 138
3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات.. 138
3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 139
3-27- حیوان آزمایشگاهی.. 139
3-28-ادجوانت فروند ناقص…. 139
3-29-گروههای تجربی و واکسیناسیون موش‌ها 140
3-30- بررسی پاسخ های همورال. 141
3-30-1- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی.. 142
فصل چهارم: نتایج ….144
4-1-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 145
4-2- قابلیت دسترسی اپی توپ ها 149
4-3-محل های N-Glycosylated.. 151
4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن.. 153
4-5-ارزشیابی توالی پروتئین.. 155
4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول. 157
4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش SDS-PAGE.. 159
4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ… 161
4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال. 162
4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی‌بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید. 162
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………164
5-1- بحث و نتیجه گیری.. 165
5-2-پیشنهادات و چشم اندازها 168
References …169
ضمائم:
فهرست اشکال :
شکل 2-1.ساختمان ویروس پاپیلوما……………………………………………………………………………………………………………………….16
شکل 2-2. نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس……………………………………………………………………………………………………………..18
شکل2-3.نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری……………………………………………..18
شکل2-4. مواردی از عفونت پاپیلوما ویروس ها……………………………………………………………………………………………………..30
شکل 2-5. مراحل اصلی پاپیلوماویروس و محل آنها در اپی تلیوم اسکوآموس…………………………………………………………….41
شکل 2-6. ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+)…………………………………………………………………………..99
شکل4-1. نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند…………………………………………………………………………………151
شکل4-2.طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و E11 تا E20 برای L2 طراحی شدند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..155
شکل 4-3. آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد……………………………………………………………157
شکل4-4. توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند…………………..158
ششکل 4-5. نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی …………………………………………………………………………………………………159
شکل 4-6.نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده 45 کیلو دالتون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….160
شکل4-7. pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده 45KD است………………………………………………………………………………………………………………………………………….160
شکل4-8. نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده 45KD است……………………………………………..161
شکل4-9. SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده 45KD است…………..162
فهرست جداول:
جدول 2-1. خصویات واکسن چهار ظرفیتی و دوظرفیتی HPV ……………………………………………………………………………….53
جدول 2-2.واکسن های پیشگیری کننده در حال توسعه……………………………………………………………………………………………61
جدول2-3.واکسن های درمانی HPV درحال توسعه………………………………………………………………………………………………..62
ﺟﺪول2-4.ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B ﻣﺨﺘﻠﻒ ……………………………………………………..72
ﺟﺪول 2-5. ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ………………………………………………………….75
ﺟﺪول 2- 6 . ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB ……………………………………………………………………………80
جدول3-1. سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV……………………………………..105
جدول3-2.گروه بندی موش های مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………141
جدول 4-1. پیش بینی اپی توپ سروتیپ های HPV 11.16.18, 31, 45 با استفاده از سرور BCPREDS……………….149
جدول 4-2.فهرست نتایج مدل سازی همولوژی برای پروتئین های L1 از HPV نوع های 11، 16، 18، 31 و 45………..150
جدول4-3. امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان می دهد…………………………………………………………153
جدول4-4. 20 اپی توپ مناسب انتخاب شده از پروتئین های L1 و L2 ………………………………………………………………154
جدول 4-5. نتایج طراحی پروتئین و محاسبه پارامترهای مربوطه……………………………………………………………………………..156
فهرست نمودار ها :
نمودار 4-1. نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال در گروههای تجربی…………………………………………………………………….163
خلاصه
سرطان گردن رحم بعد از سرطان سینه دومین سرطان شایع زنان در سراسر جهان می باشد. بیش از 90% سرطان های گردن رحم ، واجد پاپیلوما ویروس های انسانی (HPV)هستند. بیش از 100 نوع مختلف پاپیلوما ویروس انسانی وجود دارد که بیش از 40 گونه ژنوتیپی این ویروس ها، عفونت زا هستند و از آن میان حدود 15 ژنوتیپ، کارسینوژن هستند که تحت عنوان ژنوتیپ های high-risk نام برده می شوند و ژنوتیپ 18 و 16 در بین آنها عامل بیش از 90 % سرطان های مرتبط با این ویروس هستند. پروتئین کپسید L1 پاپیلوما ویروس ها زمانی که در سیستم های بیان کننده پروتئین های یوکاریوتی و پروکاریوتی بیان می شوند ذرات ویروسی مانند غیر عفونی را تشکیل می دهند که باعث القاء پاسخ آنتی بادی خنثی کننده ضد HPVs می شوند. این پروتئین اکنون نیز به عنوان واکسن استفاده می شود و احتمالا وجود پروتئین2 L در واکسن میتواند از طیف گسترده تری از تیپ های ویروسی پیشگیری کند، هرچند که اپی توپ های خنثی کننده آن شبیه به L1 توانایی حفاظت کنندگی را ندارند اما اپی توپ های آن واکنش های متقاطع را به خوبی القا می نمایند. در حال حاضر واکسن هایی که برای ویروس HPV وجود دارد، نمی تواند تمام سروتیپ های پر خطر آن را پوشش دهد و از لحاظ قیمت نیز پر هزینه است.
در تحقیق حاضر طراحی یک واکسن یونیورسال چند اپی توپی برای پروتئین های ساختمانی اصلی ویروس های HPV که شامل L1/L2 است با استفاده از استراتژی های ایمونو انفورماتیک در بررسی 6 نوع پرخطر ویروس HPV سویه های 6،11،16،18،31،45، تلاش در طراحی و ساخت واکسنی شده است که این سروتیپ ها را پوشش دهد ، در این خصوص اقدام به شناسایی بهترین اپی توپ های برانگیخته کننده لنفوسیت هایB ، برای پیشگیری از وقوع بیماری های مرتبط در جهت مطالعه به عنوان کاندید یونیورسال واکسن شد به این ترتیب با در نظر گرفتن بیشترین سطح تحریک شوندگی لنفوسیت های B- اپی توپ های پروتئین های کپسیدی L1 وL2، از نظر قابل دسترس ترین اپی توپ ها با توجه به طراحی سه بعدی آن ها، در نظر گرفتن نواحی N گلیکوزیله شده، هیدروفیلیسیته و آنتی ژنسیته، بهترین اپی توپ ها شامل بیست اپی توپ بیست اسید آمینه ای انتخاب و پس از آنالیزهای مثبت، ساختار نهایی مشتمل بر چهارصد اسید آمینه به صورت DNA طراحی شد و به صورت 1200 نوکلئوتید ترجمه معکوس گردید، سپس در جهت بهترین بیان در E.coli بهینه سازی شد. آنزیم های برش گر BamHI و HindIII به ابتدا و انتهای توالی اضافه و سپس در غالب یک ساختار ژنی در کنار یکدیگر قرار داده شد. ژن طراحی شده مذکور ، توسط شرکت بیوماتیک سنتز شده و در پلاسمید pET28a کلون گردید. پس از دریافت پلاسمید مذکور، در سلول های E.coli BL21DE3 ترانسفرم گردید. بیان پلاسمید نوترکیب در سلول های باکتری با اضافه نمودن 1میلی مولار IPTG در طول 4 ساعت کشت انجام شد و سپس پروتئین توسط ستون کروماتوگرافی Ni-NTA خالص شد و خلوص با تکنیک SDS-page تائید شد و سپس در برابر آنتی بادی anti-His در وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. جهت بررسی ایمنی زایی، واکسن کاندید همراه با ادجوانت فروند ناقص همراه با گروه کنترل PBS به گروه های موشی BALB/c (n=6 ) دو بار و به فاصله 2 هفته بصورت زیر پوستی تزریق شدند که میزان تزریق در هر سری 10 میکروگرم بود. یک هفته پس از دومین واکسیناسیون موش ها ،توتال آنتی بادی ها به روش الایزای غیر مستقیم ارزیابی شدند. نتایج نشان داد که واکسن کاندید تولید شده در میزبان باکتریایی و خالص شده به وسیله ی Ni-NTA، یک باند در حدود 45 کیلو دالتون در وسترن بلات نشان داد. همچنین واکسیناسیون با واکسن کاندید یونیورسال بر پایه ی L1/L2 HPVs منجر به افزایش قابل توجه در پاسخ ایمنی همورال در مقایسه با گروه کنترل شد.
واژه های کلیدی : پاپیلوما ویروس انسانی، پروتئین کپسید L1 و L2 ، چند اپی توپی، یونیورسال واکسن
فصل اول
مقدمه
پاپیلوما ویروس ها، گروهی از ویروس های DNA دار هستند که باعث ایجاد زگیل یا پاپیلوم در انواعی از مهره داران عالی از جمله انسان ها می شوند. همچنین بعضی از پاپیلوما ویروس ها می توانند در حیوانات و انسان ها بدخیمی ایجاد کنند. تعدادی از پاپیلوما ویروس ها به عنوان عوامل ایجاد کننده سرطان گردن رحم و سایر تومورهای اپی تلیال مطرح شده اند (1). این ویروس ها، ذراتی کروی، کوچک و بدون پوشش با اندازه ای حدود 55 نانومتر هستند که کپسید آنها تقارن بیست وجهی دارد و ژنوم DNA دو رشته ای خطی این ویروس را در بر می گیرد (6،5،4،3،2). این ویروس ها کاملا اختصاصی گونه و بافت می باشند و در سلول های اپی تلیال پوست و مخاط تکثیر می شوند و برای ایجاد عفونت پایا باید سلول های بازال را آلوده کنند (4،1).
علیرغم تنوعی که در پاپیلوماویروس ها وجود دارد، تشابه بسیار زیادی در سکانس پروتئینی و نوکلئوتیدی اعضای خانواده پاپیلوماویروس وجود دارد و ژنوم های مجزا، سازماندهی ژنتیکی مشابهی دارند (7). ژنوم این ویروس ها از 3 ناحیه مجزا تشکیل شده است که شامل ناحیه کنترلی غیر کد کننده ، ناحیه اولیه و ناحیه تاًخیری می باشد. ناحیه کنترلی حاوی توالی های تنظیمی است. ناحیه اولیه شش پروتئین غیر ساختمانی اولیه E1, E2 E4, ,E5, ,E6 ,E7 و ناحیه تاخیری، دو پروتئین کپسیدی L1 و L2 را کد دهی می کند (9،8،1). کپسید ویروس از دو پروتئین ساختمانی تشکیل شده است. پروتئین کپسید اصلی یا L1 دارای وزن مولکولی حدودا 55 کیلو دالتون است که تقریبا 80 درصد کل پروتئین های ویروس را شامل می شود (10). پروتئین کوچک یا L2 تقریبا 70 کیلو دالتون است و در کپسید ویروس جای دارد. ذرات شبه ویروسی یا VLP از پاپیلوما ویروس های مختلف به وسیله بیان ژن L1 به تنهایی یا همراه پروتئین L2 در سیستم های بیان کننده پستانداران و غیرپستانداران تولید شده است (12،11). بیان پروتئین L1 در E.coli باعث تولید ذرات شبه ویروسی کوچک می شود. این ذرات پنتامر 12 تایی بوده و دارای ساختار 20 وجهی هستند. این ذرات شبه ویروسی به خوبی سیستم ایمنی هومورال را تحریک میکنند و بعنوان واکسن پروفیلاکتیک استفاده میشوند (13). پروتئین L2 در تجمع کپسید
